賽默飛無氯仿提取RNA解決方案來了！
TRIzol試劑 1977年，科學*** Axel Ullrich 和他的同事們提出使用異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）用于 RNA 的分離純化，至1990 年，優(yōu)化該方法后，推出商業(yè)化的 TRIzol 試劑。
賽默飛TRIzol試劑是***種即用型試劑，用于在1小時內(nèi)從人類、動物、植物、酵母或細菌來源的細胞和組織樣本中提取高質量的總RNA（以及DNA和蛋白質），TRIzol試劑在樣本勻漿化時，可以破壞細胞，溶解細胞組分，同時高效的抑制RNA酶的活性，從而維持RNA的完整性。 TRIzol無氯仿解決方案 由于在TRIzol試劑的提取過程中，需要使用氯仿，而氯仿具有揮發(fā)性，會對眼睛、呼吸道、皮膚和黏膜造成刺激，因此迫切需要***種無氯仿解決方案。經(jīng)過賽默飛科學***的不懈探索，發(fā)現(xiàn)了1-溴-3-氯丙烷（1-Bromo-3-chloropropane ，BCP）可以替代氯仿，搭配TRIzol試劑提取RNA，接下來，小編就和大******睹為快——TRIzol無氯仿提取RNA的效果。 操作流程 在樣本進行勻漿化時，加入0.2mL氯仿或者0.1mL BCP，進行RNA提取。 圖1. 操作流程示意圖，詳細步驟如下： 加1mL TRIzol試劑，裂解樣本，室溫孵育5min。 加0.2 mL氯仿或 0.1 mL BCP，振蕩混勻，孵育3min。 在4°C下12000×g離心樣本15min。 取約500μL上清液至新樣本管中。 加等樣本體積的異丙醇，顛倒混勻，在4°C下孵育10min。 在4°C下12000×g離心10min，棄上清。 加1mL 75%乙醇，重懸沉淀，短暫渦旋樣本，在4°C下7500×g離心5min，棄上清液。此步驟重復***次。 干燥5-10min，加20-50μL RNase-Free水，在55°C的水浴孵育10min。 實驗結果 分別使用氯仿和BCP對5mg和20mg的兔的肝臟和腦組織，按照TRIzol試劑的說明書進行RNA提取，每組實驗設置3個重復，對得到的RNA產(chǎn)物進行含量、純度、完整性等進行評估。 RNA含量和純度 圖2. Nanodrop檢測RNA的產(chǎn)量和純度 RNA完整性測定 圖3. Agilent 2100測定RNA完整性和計算RIN指標 RT-qPCR分析 圖4. 對提取RNA進行RT-qPCR檢測內(nèi)參基因：GAPDH和ACTA2，說明BCP提取的RNA，與氯仿相比，內(nèi)參基因表達量無顯著差異。 圖5. 提取RNA進行Xeno抑制性實驗，說明，BCP和氯仿所提取出來的RNA不會擴增抑制后續(xù)的RT-qPCR實驗，降低假陰性結果的可能性，確保RT-qPCR檢測結果是準確和可控的，再次佐證了可以使用BCP搭配TRIzol試劑使用。 小結 在有機法提取RNA的過程中，賽默飛無氯仿提取后的RNA，含量高，純度好，完整性指數(shù)高，可直接做后續(xù)的RT-qPCR實驗。
(文章來源于儀器網(wǎng))
